Semana V - 12/06/08

Esta semana realizamos la "Técnica del Cometa".
En esta técnica, las células son embebidas en un gel de agarosa de bajo punto de fusión (ABPF) en un portaobjetos, sometidas a lisis y luego corridas por electroforesis durante un corto período en el buffer de corrida.

Primero empezamos preparando los portaobjetos. Para eso les pusimos ABPF, los cubrimos con un cubreobjetos y una vez que el gel se haya solidificado, retiramos el "cubre" cuidadosamente haciendo que el agar quede adherido al portaobjetos.






Luego nosotros trabajamos directamente con portaobjetos ya preparados; pero después de poner esta capa de agarosa en el gel, se deben poner las células tratadas y luego otra capa más de agarosa. Una vez terminado el preparado debe hacerse la lisis en cámara de vidrio

Nosotros, con los portaobjetos ya preparados, procedimos directamente a hacer la Técnica del Cometa.
Colocamos los portaobjetos preparados con hepatocitos humanos tratados con diferentes concentraciones de Hexaclorobenceno sumergidos en buffer en la cuva electroforética y dejamos realizar la corrida a 23V, 400mA.

Una vez terminada la corrida, observamos los cometas y la degradación nuclear en un microscópico fluorescente. Para eso fue necesario teñir las células con Bromuro de Etidio.
El Bromuro de Etidio, lo que hace es "meterse" entre las bases nitrogenadas de los nucleótidos de ADN y emite fluorescencia frente a rayos UV, que son los que utiliza el microscopio fluorescente.

A continuación verán imágenes de los cometas y lo observado en el microscópico.

Hasta la semana que viene!

Uriel Frid

Lucas Toiw

Semana IV - 05/06/08

En esta semana procedimos a trabajar con la Dra. Angela Juarez. En la misma tuvimos que obtener homogenatos de Chlorella kesseleri y Scenedesmus vacuolatus.
Para poder obtener el mismo se necesitaron:
I) Cultivo de Chlorella kesseleri y Scenedesmus vacuolatus
II) Buffer Fosfato de Potasio 0.134 M de pH 6.5
III) Buffer Fosfato de Potasio 0.134 M de pH 6.5 con Benzamidina 0.2 mM y PMSF (fluoruro de fenilmetil sulfino) 0.5 mM. Estos dos son inhibidores de proteasas.

Antes de comenzar con el procedimiento se deben hacer las siguientes preparaciones de soluciones:

* Buffer Fosfato de Potasio:
Solución stock 1 (bajo pH): PO4H2K 0.1 M (18.23 gr PO4H2K anhidro en 1000 ml de agua destilada)
Solución stock 2 (alto pH): PO4HK2 0.134 M (23.34 gr PO4HK2 anhidro en 1000 ml de agua destilada)
Preparar el Buffer 0.134 M pH 6.5 mezclando 2.5 volúmenes de Sol. 1 con 1 volumen de Sol. 2, agregándola de a poco y verificando el pH en el pHmetro, porque no es la proporción exacta.

* Buffer con inhibidores:
Prepara stock PMSF 0.2 M en etanol y stock benzamidina/ 1 buffer (preparar únicamente la cantidad de buffer con inhibidores necesaria, porque son caros y el buffer final no puede almacenarse)


Luego de haber preparado las correspondientes soluciones, se procedió a la obtención de los homogenatos de Chlorella kessleri y Scenedesmus vacuolatus:

* Cosechar las células por centrifugación (15 min. a 7000 rpm, centrifuga refrigerada)

* Descartar el sobrenadante (medio de cultivo) implementando el uso de la pipeta pasteur

* Lavar las células con 10 ml de buffer Fosfato de Potasio 0.134 M pH 6.5 conteniendo inhibidores de proteasas * Centrifugar 15 min a 7000 rpm (misma centrifuga)

* Descartar el sobrenadante (pipeta pasteur) y recoger las células resuspendiéndolas en el menor volumen posible de buffer con inhibidores ( debe quedar espeso) en un tubo apropiado para sonicar ( eppendorf o tubos centrifuga sorvall)

* Sonicar en sonicador de tip (a la maxima potencia que permita el aparato y el tip) 7 veces por 15 segundos cada vez (con el tip en un vaso de precipitados lleno de hielo y dejando enfriar entre los pulsos). Cabe destacar que el volumen a sonicar no debe sobrepasar la mitad del tubo utilizado, sino este podria romperse ya que el sonicador provoca energia intensa liberada en forma calorica.

Debido a la falta de tiempo, no pudimos seguir. Pero la tecnica termina de la siguiente manera:

* Centrifugar 25 min. a 11500 rpm
* El pellet obtenido corresponde a los núcleos, mitocondrias, cloroplastos y derbis celulares.
* El sobrenadante corresponde a la fracción soluble citosólica y que llamamos sobrenadante de homogenato o extracto algal citosólico (puede almacenarse a -20ºC por unos 15 días para determinar finalmente la actividad UroD)


Lucas Toiw
Uriel Frid

Semana III - 29/05/08

Esta semana fue destinada a la búsqueda de información en la biblioteca de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de Buenos Aires.

Cuando llegamos, fuimos con Isis a la biblioteca. Ella nos explicó como se hacía para buscar textos específicos, cómo hacer una búsqueda de información por tema y en fin, cómo se utiliza la biblioteca de la UBA.

Los temas sobre los que buscamos información fueron:
- Lineas de cultivo celular
- Hexaclorobenceno (HCB)
- Hepatocitos humanos
- Estrés oxidativo
- Antioxidantes

Una vez finalizada la búsqueda, terminó nuestra jornada de trabajo por esta semana.

Seguiremos actualizando como todas las semanas.

Uriel Frid y Lucas Toiw.

Semana II - 22/05/08

Esta semana trabajamos con dos situaciones diferentes:
En la primera parte procedimos a trabajar con Gabriela Chaufan acompañada por Isis, estudiante de segundo año de Biología.

Primero fuimos a un laboratorio equipado para trabajar con cultivos de células. Allí, luego de sacar de la estufa el preparado, observamos el crecimiento de hepatocitos humanos en microscopio invertido.

Luego, una vez que Isis y Gabriela iniciaron cultivos con 300000 células sometidas a diferentes concentraciones de hexaclorobenceno (HCB), realizamos el recuento en cámara de Neubauer.

Previo a eso, realizamos una curva del crecimiento de los hepatocitos en base a recuentos obtuvidos previamente

En una segunda etapa, acompañados por Ángela Juarez, conocimos un laboratorio completamente dedicado al cultivo de microalgas.

Mas tarde preparamos 1,2 litros de BBM suplementado con glucosa.

El BBM es un medio de cultivo para el crecimiento de microalgas verdes compuesto por:

1) NaNO₃ ................................................ 10g/400 ml agua bidestilada

2) KH₂PO₄ ................................................ 7g/400 ml agua bidestilada

3) K₂HPO₄ ................................................ 3g/400 ml agua bidestilada

4) MgSO₄ .7H₂O ......................................... 3g/400 ml agua bidestilada

5) CaCl₂ .2H₂O ......................................... 1g/400 ml agua bidestilada

6) NaCl ............................................... 1g/400 ml agua bidestilada

Las algas que vamos a sembrar dentro de dos semanas son Chlorella kessleri y Scenedesmus acutus

Para la preparación del medio de cultivo contábamos con soluciones stock concentradas de manera tal de utilizar 10ml de solución por cada litro de BBM.

Realizamos cálculos necesarios para preparar 1,2 litros.

El medio de cultivo BBM se suplementó con 1g de glucosa por litro.

Para mezclar la solución utilizamos un mezclador electromagnético:

Para atoclavar la solución, dividimos la misma en 4 erlenmeyers con 300 ml de solución. Éstos fueron tapados con tapones de algodón envueltos en aluminio.

La semana que viene volveremos a actualizar el Blog.

Uriel Frid y Lucas Toiw

Semana I - 15/05/08

Al llegar a Ciudad Universitaria nos dirigimos al laboratorio donde pasaremos a trabajar durante la pasantía.
Allí conocimos a la Dra. María del Carmen Ríos de Molina y a todo su equipo de trabajo.

Luego nos dieron una pequeña introducción acerca de lo que se trataba el proyecto.
Este proyecto, basado en la contaminación ambiental, consiste en ver como distintos agentes contaminantes como el Hexaclorobenceno (HCB) y otros, afectan a los seres vivos para poder, con posterioridad, adaptarlo a parámetros humanos. Se toma como patrón para medir la contaminación, el daño que producen estos agentes sobre la Uroporfirinógeno Descarboxilasa (UroD): enzima que actúa en el camino metabólico del grupo Hemo y una de las primeras enzimas en ser afectadas.
Al ser dañada esta enzima, se comprobó que también se daña el material genético con información para sintetizarla, lo que quiere decir que al reproducirse el ser vivo el nuevo ser sufre deformaciones genéticas que van aumentando junto con su descendencia.

Luego, procedimos a presenciar una clase sobre radicales libres dada por Ángela, que forma parte del equipo de trabajo del proyecto.

Más tarde, a las 10:00hs, interrumpimos la clase y nos juntamos con todos los chicos de ORT que estaban realizando pasantías en Ciudad Universitaria, para ver dos videos:
- El primero era sobre seguridad e Higiene dentro de Ciudad Universitaria.
- El segundo era sobre Seguridad e Higiene en los laboratorios de la facultad.

Por último, luego de los videos y de haber presenciado la última parte de la clase de Ángela, tuvimos una pequeña charla con la Dra. María del Carmen Rios de Molina en la que nos explicó todos aquellos contenidos que no nos habían quedado claros de la charla , una parte del metabolismo del Hemo y que la Uroporfirinógeno Descarboxilasa se ocupa de sustituir grupos de ácido acético por metilos en la Uroporfirina III.

A continuación adjuntamos un gráfico que realizamos explicando la función de la UroD (hacer click sobre ella para verla mas grande):


La semana que viene volveremos a actualizar el blog.

Hasta entonces

Uriel Frid
Lucas Toiw