Semana IV - 05/06/08

En esta semana procedimos a trabajar con la Dra. Angela Juarez. En la misma tuvimos que obtener homogenatos de Chlorella kesseleri y Scenedesmus vacuolatus.
Para poder obtener el mismo se necesitaron:
I) Cultivo de Chlorella kesseleri y Scenedesmus vacuolatus
II) Buffer Fosfato de Potasio 0.134 M de pH 6.5
III) Buffer Fosfato de Potasio 0.134 M de pH 6.5 con Benzamidina 0.2 mM y PMSF (fluoruro de fenilmetil sulfino) 0.5 mM. Estos dos son inhibidores de proteasas.

Antes de comenzar con el procedimiento se deben hacer las siguientes preparaciones de soluciones:

* Buffer Fosfato de Potasio:
Solución stock 1 (bajo pH): PO4H2K 0.1 M (18.23 gr PO4H2K anhidro en 1000 ml de agua destilada)
Solución stock 2 (alto pH): PO4HK2 0.134 M (23.34 gr PO4HK2 anhidro en 1000 ml de agua destilada)
Preparar el Buffer 0.134 M pH 6.5 mezclando 2.5 volúmenes de Sol. 1 con 1 volumen de Sol. 2, agregándola de a poco y verificando el pH en el pHmetro, porque no es la proporción exacta.

* Buffer con inhibidores:
Prepara stock PMSF 0.2 M en etanol y stock benzamidina/ 1 buffer (preparar únicamente la cantidad de buffer con inhibidores necesaria, porque son caros y el buffer final no puede almacenarse)


Luego de haber preparado las correspondientes soluciones, se procedió a la obtención de los homogenatos de Chlorella kessleri y Scenedesmus vacuolatus:

* Cosechar las células por centrifugación (15 min. a 7000 rpm, centrifuga refrigerada)

* Descartar el sobrenadante (medio de cultivo) implementando el uso de la pipeta pasteur

* Lavar las células con 10 ml de buffer Fosfato de Potasio 0.134 M pH 6.5 conteniendo inhibidores de proteasas * Centrifugar 15 min a 7000 rpm (misma centrifuga)

* Descartar el sobrenadante (pipeta pasteur) y recoger las células resuspendiéndolas en el menor volumen posible de buffer con inhibidores ( debe quedar espeso) en un tubo apropiado para sonicar ( eppendorf o tubos centrifuga sorvall)

* Sonicar en sonicador de tip (a la maxima potencia que permita el aparato y el tip) 7 veces por 15 segundos cada vez (con el tip en un vaso de precipitados lleno de hielo y dejando enfriar entre los pulsos). Cabe destacar que el volumen a sonicar no debe sobrepasar la mitad del tubo utilizado, sino este podria romperse ya que el sonicador provoca energia intensa liberada en forma calorica.

Debido a la falta de tiempo, no pudimos seguir. Pero la tecnica termina de la siguiente manera:

* Centrifugar 25 min. a 11500 rpm
* El pellet obtenido corresponde a los núcleos, mitocondrias, cloroplastos y derbis celulares.
* El sobrenadante corresponde a la fracción soluble citosólica y que llamamos sobrenadante de homogenato o extracto algal citosólico (puede almacenarse a -20ºC por unos 15 días para determinar finalmente la actividad UroD)


Lucas Toiw
Uriel Frid