Semana X - 17/07/08

Hola! Acá estamos de nuevo actualizando el blog.
Sinceramente de esta semana sí es mucho lo que hicimos, pero sin embargo no hay mucho para contar.

¿Que es lo que hicimos?
Repetimos el ensayo cometa vara ver una vez más el daño producido por el hexaclorobenceno sobre el núcleo celular de los hepatocitos humanos.
(Para mayor información volver a la Semana V para entender en qué consiste la técnica)

¿Como fueron los resultados?
No pudimos sacar provecho de la técnica ni cuantificar los valores cometa de los núcleos ya que contábamos con pocas células (menos de 100, el cual es el mínimo indicado en el protocolo).

Por lo tanto, un poco desilusionados pero con muchas expectativas sobre las futuras repeticiones del ensayo, finalizamos nuestra jornada.

Hasta la semana siguiente!

Uriel Frid
Lucas Toiw

Semana IX - 10/07/08

Esta semana nos dedicamos a preparar muestras nuevamente para repetir el Ensayo de Electroforesis de Células Individuales (Ensayo Cometa).
Estuvimos trabajando con Gabriela Chaufan e Isis haciendo los pasos que la vez anterior no habiamos realizado. (Ver Semana V)
Primero Fuimos al cuarto de cultivo y resuspendimos con tripsina las células tratadas con distintas concentraciones de hexaclorobenceno y las colocamos en tubos para luego preparar los portaobjetos.
Luego, partiendo de portaobjetos ya cubiertos con una capa de agarosa de bajo punto de fusión, agregamos una capa muy delgada de las células anteriormente dichas, inmersas en agarosa de alto punto de fusión.
Una vez puesta la capa, es necesario dejarlo en hielo para acelerar la solidificación del agar.
Con el medio ya sólido, retiramos los cubreobjetos y así quedan listos los preparados.
La semana próxima repetiremos la corrida electroforética esperando nuevos resultados.

Actualizaremos nuevamente la semana que viene.

Uriel Frid
Lucas Toiw

Semana VIII - 03/07/08

Esta semana nos dedicamos a continuar con lo de la semana pasada, solo que esta vez con Chlorella kessleri.

Se procedió exactamente igual que la semana pasada, solo con una diferencia: cuando quisimos hacer el recuento en la cámara de Neubauer, la mezcla estaba muy concentrada (ya estaba en una dilución al 1/2) así que la volvimos a diluir al 1/2 una vez más, obteniendo así una dilución total al 1/4.




El método de recuento fue hecho con el mismo procedimiento que en el caso de Scenedesmus.


Finalmente, se pudo obtener una media de 900.5, un Desvio Starndard de 40.62723, con un n=8 y con un valor crítico de 1.895.


Luego usando la misma cuenta, sacamos el error:

SD/raíz(n)/media . VC.100

El error nos dio 3.23142%, por lo que esta más que bien.

Después de sacar el error hicimos el mismo razonamiento que la semana pasada para calcular el número de Células de Chlorella que hay en 1 ml de cultivo:

*Si en el sector que contamos hay un volumen de 0.1x10-3 ml y el promedio obtenido fue de 900.5 Células entonces en 1 ml hay 9005000 Células.

*Esas Células se encuentran en una dilución al 1/4, por lo que se debe multiplicar por cuatro la cantidad de Células. Entonces tenemos 36020000 Células/ml.

*Nosotros en realidad teníamos 0.5 ml de muestra mas 0.05 ml de Formol, osea 0.55 ml de muestra inicial, por lo que si en 1 ml de muestra hay 36020000 Células en 0.55 hay 19811000 Células.



*Entonces: si en 0.5 ml de cultivo hay 19811000 Células, en 1 ml hay 39622000 Células.



Como conclusión podemos decir que en 1 ml de cultivo de Chlorella kessleri hay 39622000 Células, es decir muchas más que las obtenidas en Scenedesmus.

Al ser Células mas chiquitas, tienen una tasa de división celular mayor, y debido a que las células de Chlorella y las de Scenedesmus estuvieron en incubación el mismo tiempo, las de Chlorella se pudieron multiplicar mas, y de ahí viene la necesidad de volver a diluir la muestra.

Hasta la semana que viene

Lucas Toiw

Uriel Frid

Semana VII - 27/06/08

Esta semana básicamente lo que se hizo fue un recuento de Células de Scenedesmus en cámara de Neubauer.

Se trabajo con 0.5 ml de la muestra con un agregado de 0.05 ml de Formol, lo que permitia que se conservara la misma.

Debido a que la muestra se encontraba muy concentrada, con agua destilada se procedió a una dilución al 1/2 obteniendo así un recuento mas fácil.

Luego de la dilución y con un microscopio cada uno, empezamos con el conteo.

El método de recuento de Células se basa en contar las mismas por cada cuadrante (B) en los cuadrantes grandes (A) (ver imágen). Luego se suman todas las Células por cuadrante (A). Se realizan tantos recuentos como sea necesario para lograr un error menor o igual al 10% (estimado de acuerdo con las ecuaciones que figuran más abjo) y se saca una media. Esta media nos sirve para calcular el número de células por mililitro de cultivo.

La fórmula para determinar el error consiste en lo siguiente:

(SD/raíz(n)/media . VC.100

Donde SD es el Desvio Standard, VC es el Valor de Confianza de 1.895 para un n=8 donde n es el número de recuentos.

Reemplazando los valores en los respectivos lugares se obtuvo un error del 9.12176%, por lo que se procedió correctamente.

Luego queríamos saber cuantas Células habían en la muestra inicial, por lo que razonamos lo siguiente:

*Si en el sector que contamos hay un volumen de 0.1x10-3 ml y el promedio obtenido fue de 339.625 Células entonces en 1 ml hay 3396250 Células.

*Esas Células se encuentran en una dilución al 1/2, por lo que se debe multiplicar por dos la cantidad de Células. Entonces tenemos 6792500 Células/ml.

*Nosotros en realidad teníamos 0.5 ml de muestra mas 0.05 ml de Formol, osea 0.55 ml de muestra inicial, por lo que si en 1 ml de muestra hay 6792500 Células en 0.55 hay 3735875 Células.

*Entonces: si en 0.5 ml de cultivo hay 3735875 Células, en 1 ml hay 7471750 Células.

Como conclusión podemos decir que en 1 ml de muestra de Scenedesmus hay 7471750 Células.

Debido a la falta de tiempo, la semana que viene realizaremos el recuento de Chlorella kessleri.

Hasta la semana que viene,

Lucas Toiw
Uriel Frid

Semana VI - 19/06/08

Esta semana nos dedicamos a trabajar con la Dra. Gabriela Chaufan sobre los cometas obtenidos la semana anterior.


Durante el trayecto del día establecimos en la computadora, una escala arbitraria prefijada por nosotros que nos serviria para decidir los valores de los distintos cometas hayados.


Usando un programa especifico que nos permitia usar una regla con escala en cm medimos, en cada nucleo, la distancia entre la zona donde estaria ubicada la membrana nuclear hasta la punta de la respectiva cola del cometa. De esta forma, pudimos establecer los valores de todos los cometas hayados. Se considera que el valor del índice de cometa va desde 0 a 400, tomando como un valor normal hasta 10; de 11 a 400 se considera un daño al ADN.


Lo que centralmente se intenta buscar aqui es en Indice de cometa (relacionado al proceso apoptótico).
La apoptosis es la función que controla la muerte de una unidad biológica, de forma programada.
Para poder obtener el Índice se debe proceder con una sencilla cuenta que consta de la sumatoria de la cantidad hallada de cada Valor de Cometa por su respectivo Valor.

Para poder hallar el Indice de Cometa, produjimos la siguiente escala de valores:

Según el protocolo. el recuento debe hacerse sobre 100 células pero en nuestra práctica obtuvimos menos.

- de 0 a 10 = 0

- de 11 a 20 = 1

- de 21 a 30 = 2

- de 31 a 40 = 3

- > a 40 = 4

Esta tabla compara la longitud del cometa con un valor respectivo arbitrariamente prefijado por nosotros.


De este modo podemos concluir que el Índice de cometa es:

(2x0) + (9x1) + (5x2) + (2x3) + (4x0) =


0 + 9 + 10 + 6 + 0 = 25 ------> Índice de Cometa (relacionado con la apoptosis celular)

También se puede apreciar que los Cometas de Valor 1 son la gran mayoría (con un 50% del total de los cometas medidos), siguiéndoles los Cometas de Valor 0 y 3 (con un 11,11 % en ambos casos). No fueron registrados Cometas de Valor 4.

Cabe destacar que las células fueron cultivadas con una concentración de HCB de 10μg/ml.

Para finalizar el día, fuimos con Gabriela a ver otro proyecto suyo que implementa el uso de cangrejos en un criadero especifico para ellos.

Volveremos a actualizar la semana entrante.

Lucas Toiw y Uriel Frid