Semana VI - 19/06/08

Esta semana nos dedicamos a trabajar con la Dra. Gabriela Chaufan sobre los cometas obtenidos la semana anterior.


Durante el trayecto del día establecimos en la computadora, una escala arbitraria prefijada por nosotros que nos serviria para decidir los valores de los distintos cometas hayados.


Usando un programa especifico que nos permitia usar una regla con escala en cm medimos, en cada nucleo, la distancia entre la zona donde estaria ubicada la membrana nuclear hasta la punta de la respectiva cola del cometa. De esta forma, pudimos establecer los valores de todos los cometas hayados. Se considera que el valor del índice de cometa va desde 0 a 400, tomando como un valor normal hasta 10; de 11 a 400 se considera un daño al ADN.


Lo que centralmente se intenta buscar aqui es en Indice de cometa (relacionado al proceso apoptótico).
La apoptosis es la función que controla la muerte de una unidad biológica, de forma programada.
Para poder obtener el Índice se debe proceder con una sencilla cuenta que consta de la sumatoria de la cantidad hallada de cada Valor de Cometa por su respectivo Valor.

Para poder hallar el Indice de Cometa, produjimos la siguiente escala de valores:

Según el protocolo. el recuento debe hacerse sobre 100 células pero en nuestra práctica obtuvimos menos.

- de 0 a 10 = 0

- de 11 a 20 = 1

- de 21 a 30 = 2

- de 31 a 40 = 3

- > a 40 = 4

Esta tabla compara la longitud del cometa con un valor respectivo arbitrariamente prefijado por nosotros.


De este modo podemos concluir que el Índice de cometa es:

(2x0) + (9x1) + (5x2) + (2x3) + (4x0) =


0 + 9 + 10 + 6 + 0 = 25 ------> Índice de Cometa (relacionado con la apoptosis celular)

También se puede apreciar que los Cometas de Valor 1 son la gran mayoría (con un 50% del total de los cometas medidos), siguiéndoles los Cometas de Valor 0 y 3 (con un 11,11 % en ambos casos). No fueron registrados Cometas de Valor 4.

Cabe destacar que las células fueron cultivadas con una concentración de HCB de 10μg/ml.

Para finalizar el día, fuimos con Gabriela a ver otro proyecto suyo que implementa el uso de cangrejos en un criadero especifico para ellos.

Volveremos a actualizar la semana entrante.

Lucas Toiw y Uriel Frid

Semana V - 12/06/08

Esta semana realizamos la "Técnica del Cometa".
En esta técnica, las células son embebidas en un gel de agarosa de bajo punto de fusión (ABPF) en un portaobjetos, sometidas a lisis y luego corridas por electroforesis durante un corto período en el buffer de corrida.

Primero empezamos preparando los portaobjetos. Para eso les pusimos ABPF, los cubrimos con un cubreobjetos y una vez que el gel se haya solidificado, retiramos el "cubre" cuidadosamente haciendo que el agar quede adherido al portaobjetos.






Luego nosotros trabajamos directamente con portaobjetos ya preparados; pero después de poner esta capa de agarosa en el gel, se deben poner las células tratadas y luego otra capa más de agarosa. Una vez terminado el preparado debe hacerse la lisis en cámara de vidrio

Nosotros, con los portaobjetos ya preparados, procedimos directamente a hacer la Técnica del Cometa.
Colocamos los portaobjetos preparados con hepatocitos humanos tratados con diferentes concentraciones de Hexaclorobenceno sumergidos en buffer en la cuva electroforética y dejamos realizar la corrida a 23V, 400mA.

Una vez terminada la corrida, observamos los cometas y la degradación nuclear en un microscópico fluorescente. Para eso fue necesario teñir las células con Bromuro de Etidio.
El Bromuro de Etidio, lo que hace es "meterse" entre las bases nitrogenadas de los nucleótidos de ADN y emite fluorescencia frente a rayos UV, que son los que utiliza el microscopio fluorescente.

A continuación verán imágenes de los cometas y lo observado en el microscópico.

Hasta la semana que viene!

Uriel Frid

Lucas Toiw

Semana IV - 05/06/08

En esta semana procedimos a trabajar con la Dra. Angela Juarez. En la misma tuvimos que obtener homogenatos de Chlorella kesseleri y Scenedesmus vacuolatus.
Para poder obtener el mismo se necesitaron:
I) Cultivo de Chlorella kesseleri y Scenedesmus vacuolatus
II) Buffer Fosfato de Potasio 0.134 M de pH 6.5
III) Buffer Fosfato de Potasio 0.134 M de pH 6.5 con Benzamidina 0.2 mM y PMSF (fluoruro de fenilmetil sulfino) 0.5 mM. Estos dos son inhibidores de proteasas.

Antes de comenzar con el procedimiento se deben hacer las siguientes preparaciones de soluciones:

* Buffer Fosfato de Potasio:
Solución stock 1 (bajo pH): PO4H2K 0.1 M (18.23 gr PO4H2K anhidro en 1000 ml de agua destilada)
Solución stock 2 (alto pH): PO4HK2 0.134 M (23.34 gr PO4HK2 anhidro en 1000 ml de agua destilada)
Preparar el Buffer 0.134 M pH 6.5 mezclando 2.5 volúmenes de Sol. 1 con 1 volumen de Sol. 2, agregándola de a poco y verificando el pH en el pHmetro, porque no es la proporción exacta.

* Buffer con inhibidores:
Prepara stock PMSF 0.2 M en etanol y stock benzamidina/ 1 buffer (preparar únicamente la cantidad de buffer con inhibidores necesaria, porque son caros y el buffer final no puede almacenarse)


Luego de haber preparado las correspondientes soluciones, se procedió a la obtención de los homogenatos de Chlorella kessleri y Scenedesmus vacuolatus:

* Cosechar las células por centrifugación (15 min. a 7000 rpm, centrifuga refrigerada)

* Descartar el sobrenadante (medio de cultivo) implementando el uso de la pipeta pasteur

* Lavar las células con 10 ml de buffer Fosfato de Potasio 0.134 M pH 6.5 conteniendo inhibidores de proteasas * Centrifugar 15 min a 7000 rpm (misma centrifuga)

* Descartar el sobrenadante (pipeta pasteur) y recoger las células resuspendiéndolas en el menor volumen posible de buffer con inhibidores ( debe quedar espeso) en un tubo apropiado para sonicar ( eppendorf o tubos centrifuga sorvall)

* Sonicar en sonicador de tip (a la maxima potencia que permita el aparato y el tip) 7 veces por 15 segundos cada vez (con el tip en un vaso de precipitados lleno de hielo y dejando enfriar entre los pulsos). Cabe destacar que el volumen a sonicar no debe sobrepasar la mitad del tubo utilizado, sino este podria romperse ya que el sonicador provoca energia intensa liberada en forma calorica.

Debido a la falta de tiempo, no pudimos seguir. Pero la tecnica termina de la siguiente manera:

* Centrifugar 25 min. a 11500 rpm
* El pellet obtenido corresponde a los núcleos, mitocondrias, cloroplastos y derbis celulares.
* El sobrenadante corresponde a la fracción soluble citosólica y que llamamos sobrenadante de homogenato o extracto algal citosólico (puede almacenarse a -20ºC por unos 15 días para determinar finalmente la actividad UroD)


Lucas Toiw
Uriel Frid